Министерство здравоохранения Российской Федерации
Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт (ЦНИКВИ)
Научно-методический и лечебно-консультативный Центр по проблемам герпетических инфекций кожи,
слизистых оболочек, урогенитального тракта и папилломавирусных инфекций Минздрава России

"Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций"
Пособие для врачей

Пособие составлено профессором В.И.Киселевым, профессором Г.А.Дмитриевым, м.н.с. М.Ф. Латыповой.
Методическое пособие утверждено на заседании 14 секции Министерства здравоохранения РФ; протокол № 5 от 30 ноября 1999 г.

Создание новой диагностической технологии закономерно следует за открытием нового фундаментального принципа распознавания макромолекул. Так произошло после открытия основополагающего явления иммунитета, а именно способности макроорганизма синтезировать иммуноглобулины, способные с высокой специфичностью распознавать любые чужеродные субстанции. Долгие годы наиболее распространенные методы диагностики - инфекционных агентов базировались на принципе специфического взаимодействия антиген-антитело. Свойство иммуноглобулинов узнавать и взаимодействовать с высокой степенью специфичности с различными антигенными субстанциями микроорганизма (белковой и липополисахаридной природы) сделали их незаменимым инструментом для идентификации микроорганизмов. Достаточно внести в исследуемый образец антитела заданной специфичности и создать необходимые условия для протекания реакции, и в течение непродолжительного времени антитела найдут и свяжут искомый антиген. Поскольку данное взаимодействие происходит в растворе и не сопровождается какими бы то ни было визуальными проявлениями, необходимо решить вторую часть диагностической задачи, а именно, найти количественный способ регистрации происходящего взаимодействия или его отсутствия. Например, в реакции связывания комплемента взаимодействие антигена с антителом сопровождается потреблением комплемента в реакционной среде, в результате этого снижается концентрация последнего, что отражается на его способности гемолизировать эритроциты. Таким образом, в пробах, где имело место взаимодействие антигена с антителом интенсивность гемолиза существенно ниже, чем в пробах, где данное взаимодействие отсутствовало. В реакции пассивной гемагглютинации задача регистрации взаимодействия АТ-АГ решается путем сорбции антигена или антитела на поверхности эритроцитов с последующим их слипанием, что легко оценивается визуально. В иммуноферментном анализе к антителам ковалентно "пришиваются" молекулы ферментов (пероксидазы или щелочной фосфатазы). После завершения реакции в среду добавляются субстраты для названных ферментов, дающие после гидролиза цветную реакцию, пропорциональную количеству связавшихся антител, что и отражает содержание антигена в исследуемой пробе. Диагностические методы, основанные на принципе взаимодействия АГ-АТ, нашли широкое применение в лабораторной практике. Однако они обладают целым рядом недостатков при детекции антигенов, что и побудило исследователей к поиску новых решений, основанных на иных принципах распознавания макромолекул.
Один из таких принципов был описан в середине 50-х годов, когда была открыта структура ДНК. Оказалось, что молекула ДНК состоит из 4 азотистых оснований (нуклеотидов) Аденин (А), Тимидин (Т), Гуанин (Г) и Цитозин (Ц), которые, чередуясь в определенной последовательности, создают все многообразие живой природы. Молекула ДНК состоит из двух цепей, в которых напротив А всегда находится Т, а напротив Г всегда - Ц, то есть в составе молекулы пары А-Т и Г-Ц обладают высоким сродством. Если цепи молекулы ДНК отделить друг от друга путем нагрева (95°С), а затем вернуть температуру к физиологичной (37°С), то молекула с абсолютной точностью восстанавливает свою исходную структуру. Способность цепей ДНК распознавать друг друга с высокой степенью специфичности было названо правилом комплементарности. В начале 60-х годов принцип комплементарности нуклеиновых кислот был впервые использован в диагностических целях для определения вирусов. Для этого с помощью специальных методов разделяли цепи ДНК, одна из которых впоследствии метилась изотопом (такая молекула получила название ДНК- зонд) Биологическая проба, исследуемая на наличие вируса X, подвергалась температурной обработке и в нее вносился ДНК-зонд. При наличии в пробе соответствующего вируса происходило комплементарное взаимодействие родственных цепей ДНК. Факт взаимодействия регистрировался по задержке в пробе радиоактивной метки. В начале 70-х годов метод гибридизации нуклеиновых кислот, основанный на комплементарном взаимодействии, широко вошел в лабораторную практику и применяется для диагностики ряда инфекционных агентов вирусной и бактериальной природы. Одним из недостатков метода является его относительно невысокая чувствительность, которая составляет примерно 10000 - 100000 инфекционных частиц. Однако начало было положено, и принцип комплементарности нуклеиновых кислот подтвердил свою состоятельность в создании диагностических технологий. Впервые было показано, что нуклеиновая кислота может быть мишенью для идентификации биологического объекта.
Начало 80-х годов ознаменовано бурным развитием молекулярной биологии нуклеиновых кислот: разработаны методы определения нуклеотидной последовательности ДНК, разработаны основы генетической инженерии, созданы методы химического синтеза нуклеиновых кислот. Все это создавало необходимые предпосылки для новых революционных открытий в области анализа генетического материала.

Открытие полимеразной цепной реакции.

Принцип метода

Первая публикация, посвященная описанию полимеразной цепной реакции, датируется 1985 годом, в которой автор метода американский исследователь Kary Mullis, работавший в то время в компании Cetus Corporation (Сан-Диего, США), описал основополагающие принципы метода. За эту работу в 1993 году ему была присуждена Нобелевская премия по химии (1).
Суть метода состоит том, что в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной инфекционный агент, вносятся синтезированные в лаборатории нуклеотидные последовательности (праймеры), комплементарные генетическому материалу искомого возбудителя. Такие праймеры способны специфически взаимодействовать с геномной ДНК (РНК) инфекционного агента. Если исследуемую пробу подвергнуть температурной обработке, то двухспиральная ДНК, содержащаяся в инфекционном агенте, денатурирует и становится доступной для взаимодействия с двумя праймерами, комплементарными определенной зоне геномной ДНК. Подвергая такой образец повторным циклам денатурации и ренатурации ДНК, при которых происходит специфическое связывание праймеров с соответствующей зоной ДНК, в определенных условиях (содержание в реакционной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и термофильной ДНК полимеразы) происходит избирательное размножение (амплификация) участка ДНК определенного размера, который задается при выборе праймеров. Таким образом, процесс амплификации ДНК включает в себя три стадии:
• денатурация, при которой исследуется образец, помещенный в специальный прибор термоциклер или амплификатор, подвергается температурной обработке в течение 30-60 секунд. На этой стадии происходит превращение двухцепочечных ДНК в однонитевые молекулы, что делает их доступными для взаимодействия с праймерами (синтетическими молекулами ДНК, предназначенными для поиска генетического материала соответствующего возбудителя);
• отжиг или ренатурация, стадия, при которой достигаются оптимальные условия для восстановления двухспиральной структуры ДНК. В этот момент восстанавливается исходная структура нуклеиновых кислот, но поскольку в реакционной среде находится избыточное количество праймеров, то они преимущественно взаимодействуют со специфической ДНК мишенью, образуя структуры, которые являются оптимальным субстратом для ДНК полимеразы, и инициируют в дальнейшем синтез новых молекул ДНК;
• элонгация, на этой стадии ДНК полимераза инициирует синтез комплементарных молекул, используя для строительства новых молекул ДНК присутствующие в реакционной среде нуклеотидтрифосфаты. Таким образом, при наличии в исследуемой пробе молекул ДНК, комплементарных праймерам (специфичность праймеров зависит от того, какой возбудитель вы намерены обнаружить в исследуемой пробе), после каждого цикла амплификации происходит удвоение исходного количества ДНК искомого возбудителя. В отсутствие специфических молекул ДНК в исследуемой пробе образование структур, способных инициировать синтез ДНК, не происходит, и мы не регистрируем в результате реакции появление соответствующих фрагментов ДНК заданного размера.
Нарастание концентрации специфических молекул ДНК происходит в геометрической прогрессии, и после 35-40 циклов она достигает значений, при которых становится возможной визуальная регистрация молекул ДНК после фракционирования в агарозном или акриламидном гелях

Компоненты полимеразной цепной реакции

Термофильная ДНК полимераза - фермент, катализирующий синтез новых молекул ДНК Источником фермента являются бактерии термофилы, существующие при экстремальных температурах и выделенные впервые из горячих источников (гейзеров) Наиболее распространен фермент Taq- полимераза из Thermus aquaticus Следует подчеркнуть, что термоустойчивость Taq- полимеразы играет принципиальную роль в ПЦР Первые эксперименты были поставлены Kary Mullis с ДНК полимеразой из кишечной палочки, которая инактивируется при высокой температуре. Тогда после каждого цикла денатурации необходимо было вновь добавлять фермент, что повторялось 35-40 раз и существенно затрудняло постановку реакции По признанию самого Kary Mullis, выход из ситуации ему подсказала публикация российского ученого, в то время аспиранта Института общей генетики доктора Каледина В журнале "Биохимия" автор впервые в мире описал выделение и основные свойства термофильной ДНК полимеразы из Thermus aquaticus Из публикации следовало, что оптимальная температура для фермента находится в пределах 65-75°С, и фермент практически не теряет активности при 95°С. Это оказалось решением проблемы, стоило в начале реакции внести 0,5 - 1 единицу Taq-полимеразы, и она сохраняла высокую активность на протяжении всех циклов амплификации (2,3).
В настоящее время используются различные термофильные ДНК полимеразы, в том числе и модифицированные с помощью методов генетической инженерии. Поиск новых ферментов направлен главным образом на решение двух проблем: улучшение процессивности, то есть увеличение скорости синтеза ДНК (в среднем скорость составляет 1000 нуклеотидов в минуту), и точности синтеза ДНК.
Праймеры - синтетические одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды) средней протяженности от 20 до 30 звеньев. Праймеры комплементарны определенному локусу генетического материала того или иного возбудителя, и, выполняя распознающую роль (как антитела в серологических реакциях), определяют специфичность амплификации. Подбор праймеров осуществляется с помощью компьютерных программ, опирающихся на базу данных о нуклеотидных последовательностях различных микроорганизмов. Подбор праймеров осуществляется таким образом, чтобы они ограничивали в геноме искомого возбудителя фрагмент ДНК размером 200-1000 нуклеотидов и не взаимодействовали с ДНК других возбудителей. Специфичность амплификации во многом определяется температурой отжига, при которой и происходит взаимодействие праймеров с искомой матрицей ДНК. Поэтому компании, производящие диагностические наборы, тщательно проверяют теоретические расчеты эмпирическим путем.
Следует сказать, что при длительном хранении или многократном размораживании наблюдается уменьшение длины праймеров. В результате этого изменяются условия специфического взаимодействия праймеров с ДНК матрицей, что приводит к некорректным результатам при диагностике.

Дезоксинуклеотидтрифосфаты, буфер и магний
дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ служат строительным материалом при синтезе новых молекул ДНК, содержатся в реакционной среде в эквимолярных количествах. Средняя концентрация трифосфатов составляет 200 - 400 микромолей.
Taq-полимераза является Мg- зависимым ферментом, чье присутствие в среде обязательно. Обычно концентрация Мg составляет 1,5-3 мМ. Трис- HCI, обычно используемый для постановки реакции, создает буферную среду и поддерживает рН в диапазоне 7,0-8,0. Иногда для стабилизации фермента в буфер добавляется бычий сывороточный альбумин или желатин.

Другие методы амплификации нуклеиновых кислот

Полимеразная цепная реакция была впервые описана и разработана компанией Cetus Corporation. В 1989 все права на практическое использование ПЦР были выкуплены Швейцарской компанией Roche, которая стала единственным держателем патента. Другие крупные компании, сознавая перспективы ДНК диагностики, приступили к разработке собственных патентноспособных технологий ДНК-диагностики, сравнимых по чувствительности с ПЦР.
Лигазная цепная реакция (ЛЦР). Метод впервые описан в 1989 году и защищен патентом компанией Abbot Laboratories. В его основе лежит лигирование олигонуклеотидов, комплементарных определенной ДНК-мишени. Метод использует способность ДНК лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями ДНК мишени in vitro. После лигирования двух олигонуклеотидов образуется продукт, который представляет собой 1 цепочку исходной ДНК мишени и может, в свою очередь, служить матрицей для лигирования комплементарных олигонуклеотидов. Затем компоненты реакции подвергают денатурации путем нагревания и проводят гибридизацию с новыми порциями олигонуклеотидов. Поскольку один из нуклеотидов, участвующих в ЛЦР, ковалентно связан с биотипом, а другой - с щелочной фосфатазой, то выявление продуктов реакции происходит непосредственно после амплификации без использования электрофореза.
Метод ЛЦР, как и ПЦР, может быть использован для анализа уретральных, эндоцервикальных образцов и мочи для выявления различных инфекционных агентов. По данным литературы, такие характеристики ЛЦР, как чувствительность и специфичность, сопоставимы с ПЦР. Однако метод ЛЦР не получил в России широкого распространения. Причиной этому явилось отсутствие необходимых реагентов отечественного производства, а использование диагностических роботов фирмы Abbot Laboratories нецелесообразно из стоимостных соображений.
Из других методов следует упомянуть метод амплификации посредством транскрипции и гибридизационной защиты разработанный компанией Gen-Probe USA, a также NASBA-метод (Nucleic Acids Seaquence-Based Amplification). Производителем тест-систем на основе этого принципа является компания "Organon Teknika". Подробно останавливаться на особенностях этих подходов не имеет смысла, так как они мало известны в России.

Подготовка проб для исследования методом ПЦР

Подготовка клинического образца для исследования методом ПЦР сводится к освобождению пробы от примесей, способных оказать ингибирующее действие на процесс реакции амплификации. Существует два подхода при обработке проб. Наиболее надежный метод направлен на выделение из образца чистых нуклеиновых кислот за счет их избирательной сорбции. Такая очистка ДНК достигается на специальных микроколонках или с помощью сорбентов, приготовленных на основе силикогеля. Тогда исключается попадание ингибиторов в реакционную смесь и, следовательно, получение ложноотрицательных результатов, когда отсутствие положительной реакции интерпретируется как отсутствие в пробе искомого возбудителя, хотя истиной причиной отрицательного результата является ингибирование процесса амплификации за счет примесей, внесенных в пробу вместе с образцом ДНК. Тем не менее, у метода есть два недостатка:
1. Процедура очистки ДНК достаточно продолжительна, что увеличивает время постановки исследования.
2. Как показали наши опыты, в ряде случаев используемые сорбенты не задерживают низкомолекулярные ДНК. В частности, на отечественном рынке есть два типа тест-систем на основе ПЦР для диагностики Ch. trachomatis. Одна из них содержит праймеры, специфичные в отношении генов рибосомальных РНК Ch. trachomatis. Тест-система другого типа специфична к плазмидной ДНК Ch. trachomatis, имеющей размер 7 500 пар оснований, что значительно меньше хромосомной ДНК. Сравнительные исследования показали, что заведомо положительные пробы, содержащие Ch. trachomatis, подготовленные к реакции с помощью сорбентной технологии, давали положительный результат при использовании тест-систем первого типа и отрицательный при использовании диагностических наборов, специфичных для плазмидной ДНК. Детальное исследование этого феномена показало, что при подготовке пробы плазмидная ДНК терялась в процессе выделения. Этот пример иллюстрирует важность пробоподготовки как фактора, обеспечивающего качество диагностического процесса.
Второй метод подготовки проб состоит в простом лизисе исследуемого материала в сочетании с температурной обработкой. При таком способе проба обрабатывается щелочью с последующей нейтрализацией или низкими концентрациями детергентов, которые не ингибируют активность ДНК полимеразы. В некоторых случаях достаточно одного кипячения пробы (как в случае определения вируса гепатита В в сыворотке крови). Недостатком таких подходов является возможность присутствия ингибиторов реакции в пробе, что приводит к ложноотрицательным результатам. Этот метод не приемлем для исследования осадка мочи из-за высокого содержания мочевой кислоты.

Применение полимеразной цепной реакции для выявления Cnlamydia trachomatis

До недавнего времени стандартом в лабораторной диагностике инфекций, вызванных Ch. trachomatis, считался метод культуральной диагностики. Однако, поданным многочисленных исследований, чувствительность данного метода колеблется в пределах 60-80%. Кроме того, у культурального метода имеется несколько существенных ограничений. Выделение микроорганизма для получения положительного результата занимает от 3 до 7 дней. Поскольку этим методом выделяются только жизнеспособные микроорганизмы, в процессе подготовки образцов необходимо использовать строгие температурные режимы хранения и специальные транспортные среды. Еще одним ограничением является возможная неадекватность метода при исследовании различного клинического материала. Например, за счет малого числа клеток чувствительность культурального метода при анализе образцов, взятых из уретры мужчин, может быть даже ниже (50-70%), чем при использовании эндоцервикальных образцов (4).
Таблица 1

Суммированная оценка чувствительности методов диагностики заболеваний, вызванных Ch. trachomatis

В настоящее время очевидно, что наиболее чувствительным и специфичным методом выявления Ch. trachomatis является полимеразная цепная реакция или другие методы амплификации нуклеиновых кислот. В литературе описаны три типа диагностических наборов для определения Ch. trachomatis, отличающиеся в основном выбором ДНК мишеней. Это набор для определения гена основного белка наружной мембраны (Оmp1), ген 16S рибосомальной и ген хламидийной плазмиды. Наиболее чувствительными оказались последние две мишени в силу того, что данные гены содержатся в клетках в нескольких копиях (5, 6, 7). Однако в случае с плазмидной ДНК, как мы упоминали ранее, возможны артефакты при исследованиях из-за потери плазмиды в процессе подготовки пробы. Описаны также бесплазмидные штаммы хламидий, которые не выявляются такими тест-системами.

Диагностика микоплазмоза

Роль микоплазм в патологии урогенитального тракта до настоящего времени остается не вполне ясной. В значительной мере это обусловлено свойствами микроорганизмов, которые относятся к классическим внутриклеточным паразитам. Микоплазмы не имеют клеточной стенки, и их хромосома состоит примерно из 500 генов, что в несколько раз меньше стандартного прокариотического генома. Активная репродукция микоплазм возможна лишь при использовании клеточных ресурсов клетки-хозяина, что и определяет внутриклеточный способ существования возбудителя. В связи с этим для лабораторной диагностики микоплазм не всегда приемлемы традиционные методы, такие как микроскопия или культу-ральная диагностика. В последние годы были разработаны методы ДНК диагностики с использованием ДНК-зондов или полимеразной цепной реакции для следующих представителей семейства Mycoplasm: M. pneumomae, M. genitalium, Ureaplasma urealyticum, M. fermentans, M. penetrans, M. purum, M. hominis.
По мнению специалистов, к урогенитальной патологии имеют отношение M.genitalium, Ureaplasma urealyticum и M.hominis (8).
Однако данные последних лет свидетельствуют о том, что наиболее значимым микроорганизмом, с клинической точки зрения, является U. urealyticum, которая обнаруживается примерно у 50% обследованных женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза. Установлено, что U. urealyticum может быть причиной хориоамнионитов, преждевременных родов, патологии новорожденных. Установлено, что уреаплазмы имеют 14 сероваров, которые отличаются различной степенью патогенности и устойчивости к проводимой терапии. Все серотипы разделяются на два биовара по фенотипическим и генетическим признакам. Биовар parvo включает 4 серотипа: 1, 3, 6, и 14, а биовар I960 состоит из 10 серотипов.
В последние годы основные усилия исследователей направлены на разработку методов быстрого типирования различных сероваров U.urealyticum, так как это имеет большое прогностическое значение. Типирование биоваров методом ПЦР позволило идентифицировать биовар parvo у 81% беременных женщин. Биовар I960 преобладал у женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза и чаще обладал устойчивостью к тетрациклину (55 против 18%), чем биовар parvo (9).
Недавно группой канадских ученых под руководством Prof. M.Chernensky была разработана методология одновременного определения в клинических образцах U. urealyticum, M. hominis и M. genitalium (multiplex PCR) (10). Использование такого подхода позволит в ближайшем будущем определить роль микоплазменной инфекции в патологии урогенитального тракта.

Полимеразная цепная реакция в диагностике вирусных урогенитальных инфекций

Папилломавирусная инфекция принадлежит к группе инфекций передаваемых половым путем, о чем свидетельствуют многочисленные эпидемиологические данные. В настоящее время описано около 70 типов вирусов папилломы человека (ВПЧ), однако только некоторые из них представляют значительную угрозу для здоровья. Наиболее значимым с этой точки зрения является вирус 16 типа HPV16. Многочисленные литературные данные указывают на однозначную связь между данным типом вируса и цервикальным раком (11). Цервикальный рак занимает второе место по распространенности среди опухолевых заболеваний у женщин (12). Важным эпидемиологическим фактором в распространенности этого заболевания является раннее начало половой жизни и частая смена партнеров (13). В 90% случаев в биопсийном материале цервикальных карцином обнаруживается ДНК HPV16. В последние годы получены новые данные на молекулярном уровне, подтверждающие онкогенность вируса папилломы. Установлено, что белки Е6 и Е7, кодируемые HPV 16, способны вызывать клеточную трансформацию. Показано, что белок Е7 взаимодействует с клеточным белком р53 -супрессором трансформации клеток, и вызывает его деградацию, что открывает путь к перерождению инфицированной вирусом клетки. Таким образом, HPV16, если и не является прямой причиной цервикального рака, то с высокой долей вероятности способствует его развитию (17). Другие типы вируса папилломы (HPV 6 и 11) вызывают появление остроконечных генитальных кондилом.
Впервые рак шейки матки описывается как заболевание, передающееся половым путем, в статье Rigoni-Stern, датируемой 1842 годом (11). На обширном статистическом материале автор исследует проблему возникновения данного заболевания и приходит к выводу, что рак шейки матки встречается чрезвычайно редко среди девственниц, причем разных возрастных групп, и весьма распространен среди женщин, ведущих активную половую жизнь. Хотя причины возникновения этого опасного для жизни заболевания не были известны, его эпидемиологические характеристики указывали на наличие инфекционного агента, распространяющегося в человеческой популяции при половых контактах. За последнее десятилетие накоплены многочисленные цитологические, иммуногистохимические данные, указывающие на прямую связь между папилломавирусной инфекцией и возникновением цервикального рака. По данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется около 600000 случаев этого вида опухоли и, несмотря на проводимые лечебные мероприятия, смертность от рака шейки матки составляет 45-50%. По мнению многих авторов, возникновение данного заболевания ассоциировано с вирусами папилломы человека, передающимися при половых контактах (13). Многолетние наблюдения Syrjanen К. с соавт. (13) женщин, инфицированных вирусом папилломы человека (HPV), позволили прийти к следующим выводам:
1. HPV является инфекцией, передающейся половым путем, и может считаться фактором риска в возникновении рака шейки матки.
2. HPV является причиной предопухолевых состояний, что подтверждается морфологическими и иммуногистохимическими данными, а также результатами ДНК гибридизации.
3. Трансформированные вирусом клетки эпителия шейки матки с высокой вероятностью приводят к возникновению цервикальных карцином, если не предпринимаются своевременные меры по лечению предраковых состояний.
4. Генитальная HPV инфекция может длительное время существовать в латентном состоянии, причем это явление не зависит от пола пациента.
5. Прогнозы по поводу онкогенной трансформации при инфицировании вирусом, вероятно, зависят от типа вируса и физического состояния его ДНК (т.е. произошла или нет интеграция генома вируса в клеточный геном).
6. Опухолевая трансформация возникает с большей вероятностью при взаимодействии HPV с другими канцерогенами или инфекционными агентами.
7. Иммунологические механизмы защиты могут влиять на течение инфекционного процесса.
По итогам 4-летних наблюдений папилломавирусная инфекция в 15-20% случаев заканчивается возникновением той или иной онкологической патологии генитальной сферы (14).
С появлением молекулярных методов исследования (гибридизация и амплификация нуклеиновых кислот) появилась возможность детально изучать структуру вирусов папилломы человека. В настоящее время описано более 70 типов вирусов, циркулирующих в человеческой популяции. Клинически все папилломавирусы человека подразделяются на три типа:
1. "низкого риска" HPV - 6, 11, 42, 43, 44
2. "среднего риска" HPV- 31, 33, 35, 51, 52, 58
3. "высокого риска" HPV - 16, 18, 45, 56
Высоким онкогенным потенциалом обладают вирусы типа 16 и 18, которые обнаруживаются у 95% женщин с цервикальным раком. Высокую степень ассоциаций HPV "высокого риска" с неоплазией эпителия цервикального канала доказывают результаты, представленные в таблице 2.
В таблице 2 приведены данные встречаемости различных типов вируса в биоптатах рака шейки матки, полученных от 600 пациенток.
Таблица 2

Помимо эпидемиологических данных существуют многочисленные экспериментальные подтверждения онкогенности HPV. Установлено, что НРV тип 16 и 18, ассоциированные с раком шейки матки, способны трансформировать эпителиальные клетки in vitro. Трансфекция нормальных кератиноцитов молекулами ДНК вирусов высокой группы риска (16,18,31 и 33) приводит к иммортилизации клеток мишеней, которая сопровождается высокой транскрипционной активностью вирусных генов и интеграцией вирусного генома в клеточный. Аналогичные эксперименты по трансфекции клеток молекулами ДНК, выделенными из вирусов "низкой" группы риска, не приводят к подобным эффектам. Для эффективной трансформации первичных клеточных линий, полученных из эпителия шейки матки, помимо вирусного генома необходима активация клеточных онкогенов Harvey ras. Интеграция вирусной ДНК, вероятно, способствует неоплазии, так как в большинстве клеточных линий, полученных из цервикальных карцином, обнаружены интегрированные копии вирусных геномов. Пролиферативная активность клеток, содержащих HPV, вероятно, обусловлена экспрессией генов Е6 и Е7. Значение этих генов было продемонстрировано в экспериментах по ингибированию митотической активности опухолевых клеток, обработанных соответствующей антисмысловой РНК. Ген Е7 в изолированном виде под контролем промоторов, обеспечивающих его экспрессию, вызывает иммортилизацию кератиноцитов человека, что определенно указывает на его онкогенные свойства. Следует подчеркнуть, что около 15% клинически здоровых женщин выделяют вирус папилломы человека, что позволяет отнести их к группе риска (16).
С появлением полимеразной цепной реакции в арсенале диагностических методов выявление вируса в урогенитальных пробах предельно упростилось. ПЦР позволяет не только с высокой чувствительностью обнаружить ДНК вируса, но и определить его тип, что исключительно важно в прогнозировании заболевания. Было установлено, что ПЦР обладает достаточной чувствительностью для обнаружения вируса в моче, что имеет большую практическую ценность, так как позволяет, прибегая к неинвазивным методам, проводить широкие эпидемиологические исследования. Такая работа была проведена шведскими учеными. Оказалось, что примерно 8% здорового населения выделяют с мочой вирус HPV 16. Среди женщин, посещающих гинекологические клиники, этот процент достигал значения 49%.

Генитальный герпес.

Герпетическое поражение половых органов является одним из наиболее распространенных заболеваний в сфере клинической вирусологии. По данным ВОЗ, заболевания, вызванные вирусом простого герпеса (ВПГ), занимают второе место (15,8%) после гриппа как причина смертности от вирусных инфекций. Только в США ежегодно регистрируется около 100 млн. случаев заболевания герпесом. В России такая статистика не ведется в силу недооценки данного вида инфекции для здоровья населения. Однако приблизительные расчеты показывают, что с учетом рецидивирующего течения инфекции мы имеем сопоставимые цифры по распространенности этого заболевания. Серологические исследования показывают, что примерно 20-40% взрослого населения имеют антитела к ВПГ-2. Несмотря на столь широкое распространение инфицированности среди общей популяции выделяют группы риска по ВПГ-инфекциям. Эти группы характеризуются высокой восприимчивостью к вирусу, частыми рецидивами и очень тяжелым течением заболевания. Как правило, у этих лиц обнаруживаются значительные отклонения в иммунном статусе. Вирусы герпеса человека передаются при контакте через кожу, слизистые оболочки, гениталии, глаза и легкие. Вирус простого герпеса 1 типа обычно вызывает поражения, локализованные в верхней части тела (губы, лицо, руки, туловище). ВПГ-2 поражает, как правило, область гениталий, ягодицы, ноги. Однако в последние годы многие клиницисты наблюдают стирание границ в отношении анатомического тропизма вирусов, что проявляется в обнаружении ВПГ2 при поражении слизистых полости рта и ВПГ1 при поражении гениталий. Генитальный герпес характеризуется рецидивирующим течением и невозможностью полного исцеления. Клинически проявляющийся у матери генитальный герпес является источником инфицирования плода во время родов и вызывает развитие неонатального герпеса. Возможен и трансплацентарный путь передачи инфекции. В этом случае развивается генерализованная форма с тяжелыми поражениями не только кожных покровов, но и внутренних органов: печени, селезенки, надпочечников, головного мозга.
До недавнего времени большинство методов лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций являлись серологическими. Однако эти методы имеют лишь относительную диагностическую ценность и не позволяют с достаточной степенью достоверности установить этиологию той или иной формы болезни.
Конечно, наиболее достоверным методом диагностики считается выделение вируса в культуре клеток. Однако такой подход малоприемлем для повседневной лабораторной диагностики в силу его продолжительности и стоимости.
Наиболее чувствительным методом выявления герпесвирусов, по мнению большинства специалистов, является цепная полимеразная реакция. Материалом для исследования может служить содержимое везикул, взятое из очага поражения, пробы из уретры или цервикального канала, кровь или слюна. Особое значение лабораторная диагностика ВПГ имеет при асиптомном герпесе, когда заболевание не имеет явной клинической картины, но патологические процессы присутствуют, и больные, выделяя вирус при контактах, инфицируют партнеров. По мнению специалистов, беременные женщины должны быть обследованы на предмет асимптомного герпеса в обязательном порядке во избежание развития неонатального герпеса у новорожденного. Следует подчеркнуть особое значение дифференциальной диагностики между ВПГ-1 и ВПГ-2. Дело в том, что ВПГ-2 рассматривается как один из факторов риска возникновения рака шейки матки. Установлено, что один из фрагментов ДНК вируса обладает трансформирующей активностью. Существуют литературные данные, указывающие на то, что сочетанная ВПГ2 и HPV16 инфекция значительно повышает вероятность возникновения рака (14, 15). С помощью полимеразной цепной реакции можно легко дифференцировать два типа герпесвирусов и также оценивать наличие в исследуемых пробах фрагмента ДНК ВПГ2, обладающего онкогенной активностью.

Проблемы и перспективы использования полимеразной цепной реакции
в лабораторной диагностике урогенитальных инфекций
Диагностическая ценность ПЦР признана во всем мире. С каждым годом растет число лабораторий, использующих этот метод для диагностики инфекционных заболеваний. Особенность развития рынка ПЦР-диагностики в нашей стране состоит в том, что диагностические лаборатории используют так называемые house-made тест-системы, т.е. диагностические наборы, а точнее наборы реагентов, произведенные в условиях научно-исследовательской лаборатории.
В лабораториях с современным оснащением, высококвалифицированным персоналом имеется возможность оптимизировать условия ПЦР, проверять характеристики отдельных реагентов, соответственно, качество ПЦР диагностики достаточно высоко. Однако следует констатировать, что большинство клинических лабораторий не имеют такой возможности, что отражается на качестве диагностики.
В связи с этим мы сочли целесообразным рассмотреть в настоящем пособии основные причины ложно-отрицательных и ложно-положительных результатов при ПЦР-диагностике инфекционных заболеваний.

Причины ложно-отрицательных результатов

Одной из основных причин такого рода результатов является наличие в исследуемой пробе ингибиторов реакции. Чаще всего с такими результатами приходится сталкиваться при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, так как эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени.
Проверить наличие ингибиторов в исследуемой пробе можно путем добавления аликвоты пробы в образец с контрольной ДНК-мишенью, имеющийся в каждом наборе. Если в результате проведенного эксперимента не получается ожидаемый фрагмент ДНК, то исследуемый образец содержит ингибирующие компоненты В этом случае необходимо еще раз тщательно отмыть образец, убедиться в высоком качестве реагентов, используемых для выделения ДНК, и повторить реакцию амплификации.
Вторая причина - это низкая активность фермента-Taq полимеразы и деградация дезоксинуклеотид трифосфатов или олигонуклеотидных праймеров, обусловленная неправильным хранением или частым замораживанием и оттаиванием реагентов.
В этом случае наблюдается, как правило, снижение эффективности амплификации контрольного образца ДНК и вам следует поменять реагенты, используемые для анализа.

Причины ложно-положительных результатов

Основной причиной ложно-положительных результатов является так называемая перекрестная контаминация продуктами амплификации. Как уже упоминалось выше, в ходе постановки реакции происходит избирательное размножение участка ДНК (ампликона) искомого возбудителя. Количество ампликона в пробе при завершении реакции может достигать миллиардов копий. При неосторожном обращении с пробами после реакции амплификации, даже просто при открывании пробирки трудно избежать аэрозольного выброса микроколичеств реакционной смеси в атмосферу рабочего помещения. При этом может происходить контаминация воздуха, рабочей поверхности, перчаток, пипеток и т.д. Учитывая тот факт, что чувствительность реакции составляет единичные молекулы ДНК, а при аэрозольном выбросе возможно попадание в атмосферу сотен тысяч молекул, то очень высока вероятность попадания ампликона в исследуемые пробы. В этом случае вы получаете положительные результаты не вследствие наличия в пробе искомого инфекционного агента, а в результате размножения ампликона.
Описанные события наиболее вероятны, если проба-подготовка и электроферетический анализ продуктов амлификации проводятся в одном помещении. Именно поэтому при организации ПЦР-лаборатории следует предусмотреть наличие трех помещений для изолированного проведения основных этапов исследования:
1. Подготовка проб
2. Подготовка реагентов и проведение амплификации
3. Электрофоретический анализ продуктов амплификации и регистрация результатов.
Необходимо закрепить за каждой комнатой лабораторное оборудование, включая пипетки и халаты. Соблюдение этих правил на практике гарантирует от перекрестных контаминации. Однако для полной уверенности необходимо регулярно ставить отрицательный контроль. Помимо соблюдения этих правил, существуют также другие подходы, позволяющие минимизировать вероятность контаминации. Один из наиболее эффективных приемов состоит в использовании N-урацил гликозилазы. В этом случае реакционная смесь для амплификации содержит уридинтрифосфат (УТФ) вместо ТТФ и урацил-гликозилазу. В процессе синтеза ДНК в состав ампликона включается УТФ, который гликозилируется урацил-гликозилазой. Любая молекула ДНК, содержащая в своем составе гликозилированный УТФ, становится термолабильной и разрушается при нагревании.

Список литературы

1. Mullis К.В. and Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Method Enzymol. 1987, 155, 335.
2. Mullis K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction Sci.Am., 1990, 262, 56.
3. Каледин А.С., Слюсаренко А.Г., Городецкий С.И. Выделение и свойства ДНК-полимер зы из экстремально-термофильной бактерии Thormus aquaticus YTI. "Биохимия" т. 45, вып. 4, 1980, стр. 644.
4. Carolyn M. Black. Current method of Laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Clinical Microbiology Reviews, 1997, v. 10, № 1, p. 160-184.
5. Holland S.M., Gaydos C.A. and Quinn T.C. Detection and differentiation of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification, J.Infect. Di 1990, 162,984.
6. Chen K., Neimark H., et.al. Broad range DNA probes for detecting and amplyfying eubactei nucleic acids. FEMS Microbiol. Lett., 1989, 57, 19.
7. StaryA., Tomazic-Allen S., et.al. Comparison of DNA amplification Methods for the detectic of Chlamydia trachomatis in first-void urine from asymptomatic military Recruits. Sexually Transmitted Diseases, v. 23, № 2, p. 97-102.
8. Shmuel Razin. DNA probes and PCR in diagnosis of mycoplasma infections Molecular and Cellular Probes, 1994, 8, 497-511.
9. Marianne Abele-Horn, Christine Wolff, et.al. Association of Ureplasma urealyticum Biovars with clinical outcome for neonates, obstetric pationts and gynecological patiens with pelvic inflamatory disease. J. of Clinical Microbiology, 1997, v. 35, № 5, pp. 1199-1202.
10. S. Chong, D. Jang, M. Chernesky et.al. Development of a new multiplex PCR for the detec tion of genital Mycoplasmas. American Society for Microbiology, General Meeting. 1999, Chicago, Abstracts, p. 181.
11. G.Cross. S. Jablonska. H. Pfister, H.E. Stegner. "Genital Papillomavirus Infections", 1989.
12. Syrjanen K. Human papillomavirus (HPV) infections of the female genital tract and their associations with intraepithelian neoplasia and squanous cell carcinoma. Pathol.Ann., 198 21,53-89.
13. Syrjanen K. Mantyjarvi R., Saarrikoski S., Vayrynen M., Syrjanen S., Parkkinen S., Yliskosk M., Saastamomen J., Castren O. Factors associated with progression of cervical human papillomavirus (HPV) infections into carcinoma in situ during a long-term prospective follow-up. Br. J. Obstet Gynaecol 95, 1988, 1096-1102.
14. Olsen A.O., Orstavikl., Dillner J., Vestergaard B.F., Vagnus P. Herpes simplex virus and human papillomavirus in a population-based case-control study of cervical intraepithelial neoplasia grade ll-lll. APMIS, 1998, 106,417-424.
15. Hara Y., Okuno Y, Minekava Y. Effect of herpes simplex virus on the DNA of human papillo-ma 18. J. Med. Viral., 1997, 53(1), 4-12.
16. Southern S.A., Herringtone C.S. Molecular events in uterine cervical cancer. Sex Transm. Infect., 1998, 78, (2), 101-109.
17. LevineA.J., Momand J., FinleyC.A. The p53 tumor supressor gene. 1991, Nature, 351, 45 456.