1. Теоретические основы

Достоверность метода ПЦР диагностики по данным разных авторов составляет от 95% до 100%. Однако, информативность получаемого результата зависит от правильности выбора материала для исследования. Анализ методом ПЦР выявляет ДНК возбудителя в конкретном биологическом материале, который был представлен на исследование. В зависимости от свойств возбудителя, формы и стадии заболевания это может быть мазок, соскоб, кровь, моча, слюна, раневое отделяемое, биоптат.

Специфичность. Под специфичностью понимают способность тест-системы дифференцировать искомого возбудителя (ДНК) от близкородственных микроорганизмов.

Воспроизводимость. Под воспроизводимостью понимают способность метода давать тот же результат при повторном тестировании.

Чувствительность. Под чувствительностью понимают то минимальное количество микроорганизма (ДНК), которое способна выявлять данная тест система.

Аналитическая чувствительность- минимальное количество микроорганизма, при котором тест система обладает 100% воспроизводимостью.

Расхождение результатов различных исследований

Специфичность и чувствительность ПЦР тест-системы прежде всего зависит от структуры праймеров. В тест-системах разных производителей используются праймеры различной структуры, что может обуславливать получение отличающихся результатов. Так например, при Государственных испытаниях нескольких ПЦР тест-систем (скачать) установленно, что совпадение результатов наблюдалось в 90%- 98% случаев.

Помимо этого большие сложности возникают при сопоставлении результатов ПЦР с другими методами исследования, например, с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА). Часто встречается ситуация, когда ПЦР-анализ на хламидии дает отрицательный результат, а ИФА выявляет противохламидийные антитела. Причиной подобного расхождения могут быть:

1. “Иммунологический след” - остаточный уровень антител после ранее перенесенной инфекции.

2. Перекрестные реакции ИФА-тест-системы (специфичность ИФА ниже чем ПЦР) - выявление антител к другим видам хламидий, в том числе, респираторным - С. pneumonia, C. pecorum, C. psitaci;

Поэтому мировые руководства и стандарты не рекомендуют постановку диагноза "хламидиоз" по наличию антител IgA, IgM, IgG . Также не рекомендовано использовать определение антител для установления излеченности хламидиоза. Подробнее о хламидиозе...

3. Получение материала для ПЦР-анализа получен не из места локализации инфекционного агента. Например, при хроническом сальпингите (воспалении маточных труб) хламидии могут быть не обнаружены в области шейки матки

Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализе не выявляются специфические антитела. Это возможно при хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией либо при взятии анализов в серонегативный период, когда, несмотря на клинические проявления заболевания, антител еще нет

3. Ошибки метода ПЦР

Существуют два вида ошибок при проведении ПЦР-анализа: - Ложноположительные - положительный результат, когда на самом деле возбудитель в пробе отсутствует - Ложноотрицательные - отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе Причина этих ошибок может быть как на этапе исследования в лаборатории (лабораторная ошибка), так и на до- или пост-лабораторном этапе

Ложноположительные результаты на до- и пост- лабораторных этапах

Контаминация пробы на стадии забора материала. Контаминация (загрязнение) пробы возникает при использовании инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных “положительной” ДНК или микроорганизмами. Способ решения этой проблемы очевиден. Мы рекомендуем использовать только одноразовые зонды и пробирки для забора биологического материала.

Неправильная тактика обследования пациента. Выявление микробов, которые в норме могут присутствовать у человека. Например, эпидермальный стрептококк является нормальным обитателем кожи человека,  Neisseria spp. в норме может существовать в полости рта и на других слизистых. Для некоторых возбудителей большое значение имеет количество, в котором они обнаруженны подробнее...

Ложноположительные результаты на лабораторном этапе

Контаминация. Наиболее трудновыявляемый вид ошибок. Контаминация (загрязнение) может быть как в отдельных пробах, так и во всех пробах (тотальная контаминация). Для предотвращения этого необходимо четко разграничивать ПЦР-лабораторию на "зоны" (прием материала, выделение ДНК и РНК, постановка ПЦР, учет результатов), использовать ультрафиолетовые лампы, недопускать проведение работ в необработанном помещении (особенно это касается "экспресс-диагностики"). Сокращение времени проведения анализа, к сожалению, увеличивает вероятность контаминации. В нашей лаборатории при постановке ПЦР обязательным является использование "отрицательных контролей" . Однако все эти мероприятия повышают трудоемкость и себистоимость проведения анализов и требуют существенных "лабораторных площадей". Поэтому наш Центр не проводит "экспресс-анализов" методом ПЦР (анализ по "cito").

Перекрестные реакции. В некоторых случаях возможна положительная реакция при наличии в пробе большого количества близкородственного микроорганизма. Эта проблема решается использованием более специфичных тест-систем. Например для исключения ложноположительных реакций на Chlamydia trachomatis в нашей лаборатории возможно проведение анализа NASBA (подробнее...) Это позволяет исключить ошибки при постановке диагноза " хламидиоз ".

Ложноотрицательные результаты на до-лабораторном этапе

Неправильный забор материала. Метод ПЦР способен выявить ДНК микроба в том объекте, который был доставлен на исследование. Так, например, для выявления внутриклеточных микроорганизмов (хламидий) необходимо брать для исследования соскоб эпителиальных клеток. Несоблюдение правил забора материала (взятие поверхностной слизи вместо соскоба клеток) может повлечь за собой ложноотрицательный результат исследования на хламидиоз. Поэтому забор материала должен осуществлять квалифицированный специалист (врач).

Неправильная тактика обследования пациента. Выбор метода обследования без учета особенностей возбудителя. Например ДНК некоторых возбудителей неинформативно выявлять в крови ( Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorhoeae). Или забор материала в период реммисси (для инфекций протекающих с периодами обострений и реммиссий).

Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР. Гепарин и некоторые препараты для местного лечения способны ингибировать (тормозить) реакцию ПЦР. Поэтому забор материала должен проводиться до лечебных манипуляций. Существует несколько вариантов решения этой проблемы. В состав большинства современных тест-систем входит "внутренний контроль" - специальный фрагмент ДНК, который амплифицируется вместе с микробной ДНК.

В нашей лаборатории также используется амплификация гена бета-глобина человека. Во всех пробах, содержащих ДНК человека, например кровь (подробнее) или эпителиальные клетки, должен присутствовать этот ген. В некоторых случаях, при несрабатывании внутреннего контороля, может потребоваться дополнительная очистка ДНК, что увеличивает продолжительность выполнения анализа. Выявление гена бета-глобина можно использовать и для контроля попадания эпителиальных клеток (см. "неправильный забор материала").

Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы. Это может происходить при несоблюдение правил транспортировки и хранения проб. Например, кровь нельзя замораживать. При необходимости длительного хранения важно соблюдение температурного режима

Ложноотрицательные результаты на лабораторном этапе

Потери ДНК во время пробоподготовки. Это может происходить при несоблюдение технологии выделения ДНК, использование некачественных реактивов, низкой квалификации персонала. Добавление "внутреннего контроля" до выделения ДНК или амплификация бета-глобина позволяет решить эту проблему. Сокращение времени выполнения анализа (анализ "cito") также увеличивает вероятность "потери" ДНК.